hallo
und zwar wollte ich nachfragen ob ich das auch richtig verstanden habe:
PCR Ansatz:
DNA
2 Primer
DNA-Polymerase (taq Polymerase)
dNTPs
Mg²+ Ionen (für die FUnktion der Polymerase)
Pufferlösungen (MgCl2)

Unterschied zum Sanger Ansatz:
1 Primer statt 2 (
dNTPs (mix) und ddNTPs

Ansonsten sind da keine Unterschiede zwischen den Ansätzen oder?

Danke für die Hilfe

LG

Hi,
ja also generell schon richtig.
Bei der PCR verwendet man meist (oder immer?) die thermostabile Taq Polymerase, welche man natürlich auch bei der Sanger-Sequenzierung einsetzen kann.
Oder aber man verwendet das Klenow Fragment, dann unterscheidet sich der Ansatz insofern von der PCR dass man sich diesen ganzen Denaturieren-Primer Annealing-Primer Extension Zyklus spart und das Ganze auch nicht in einem Thermocycler durchgeführt wird.

Hoffe keinen Blödsinn erzählt zu haben, lern selbst grad fürs Kolloquium .

lg

Ok danke
also wenn ich das richtig verstanden habe wird aber die taq polymerase heutzutage häufiger verwendet,weiß aber jetzt nicht, ob ich da was durcheinander bring!?

SO ich bin mittlerweile mit den Unterlagen für Genotype durch, beim durchsehen der Prüfungsfragen ist jetzt noch die eine oder andere Frage aufgetaucht, wäre schön wenn mir jemand helfen könnte:
Was sagt ein E-value von 0,05 bzw 4*10^-6 bei der Blast suche aus?
-> The smaller the resulting E-value, the less probable is the occurrence of an alignment arising just by chance.
E-values >0,001 are considered as statistically insignificant
das wäre meine antwort, weiß aber nicht ob das stimmt?

Southernblot Markierungen beschreiben:
DIG-Labeling protocols: PCR Labeling, Random-primed labeling method.....

Vorbereitung auf den Southern blot
da fällt meiner meinung nach alles drunter, von der Wahl der Membran, Depurinierung, Denaturieren, Fixierung etc

Was gehört in einen Restriktionsansatz?
Habe ich bisher in den Unterlagen nicht gefunden

In den Übungen arbeitet man mit dem kappa-casein gen (494bp). Nach Restriktionsverdau erhält man die gewünschten Banden bei 85 bp, 277bp und 132 bp und noch eine Bande bei ca 500bp. Was könnte das sein? Was könnte man tun um herauszufinden, um was es sich handelt?
Also Geleletrophorese u Southern Blot?

Wäre echt nett wenn jmd so lieb wäre u mir da helfen würde?:)

DANKE:)

Mein Tipp: Lies dir vlt auch mal das Laborprotokoll durch, du findest die Antwort zum Restriktionsansatz (S.13) u. Ä. darin.
Lg

P.S.
wenn das Signal nach der Elektrophorese am 3. Arbeitstag ausgeprägt genug ist, kannst du den Genotypen eigentlich schon bestimmen. Der Southern Blot dient nur dazu, falls du, wg. den vielen Reinigungschritten einfach ein zu schwaches Signal hast.

Bin heute etwas langsam, was könnte ein Bande wohl bedeuten, die so groß ist wie dein Ausgangsenzym?

Danke für die schnelle Antwort und den Tipp mit dem Restriktionsansatz, das hab ich wohl übersehen, eigentlich hab ichs mir ja schon alles durchgelesen, sitz aber heute schon den ganzen Tag u bin schon etwas durcheinander
Deswegen steh ich ws auch mit der letzten Frage...mir is klar wo die Banden gebildet werden, aber was ich mit der einen anfangen soll weiß ich eben nicht...

Es wäre wirklich wichtig, ich habs bis jetzt nicht rausgefunden, ws is es total einfach, aber morgen is die Prüfung!
;D

Hi nochmal,
also ich werde mal versuchen deine Fragen nach besten wissen und gewissen zu beantworten .



Da würd ich exakt dasselbe schreiben. Dein Erwartungswert (ich übersetz das mal so) sagt dir einfach, wie statistisch bedeutend ein alignement ist und wie großt die Wahrscheinlichkeit ist dass eine solche Übereinstimmung zufällig auftritt.



Ich würd mal grob zwischen Nicht-radioaktiver (DIG-System/ Biotin-Streptavidin-System) und radioaktiver (32P, 35S) Markierung unterscheiden. Was du da aufzählst sind die zu befolgenden Protokolle falls man sich für die DIG-Markierung entscheidet.



Is auch meine Meinung. Würd alles erwähnen bis zur Hypridization Analyses, obwohl genau genommen zur Vorbereitung wohl nur die Resitriction Endonuclease Digestion, die optionale Depurination (Reinigung), die Denaturierung und vielleicht auch der Transfer dazuzählt.



Wurde schon einmal im Forum beantwortet: Puffer, (Plasmid) DNA, Reistriktionsenzym (na nona^^), Wasser



Wurde ebenfalls schon im Forum beantwortet: Die Bande bei 500 bp (genau wirds wohl 494 bp sein) ist das unverdaeute Stück, das unverdaunte DNA-Fragment das wir benutzen

lg

Und ja zum nachweisen empfiehlt sich Gelelektrophorese und wenn dann noch Zweifel bestehen sollten Southern Blot

Danke für deine Hilfe