Hallo alle!
Habe viele Fragen zum Stoff, zB:
1) Kunert, Teil 3 - Gentransfer/Vaccinia-TK-Selektionssystem, Folien 20 und 21:
Warum können TK-negative Zellen wachsen? Was integrieren diese in ihre DNA und in die Viruspartikel?

Wenn jemand etwas weiß oder darüber diskutieren möchte, wäre ich sehr dankbar!
LG

Es gibt in der infizierten Zelle 2 unterschiedliche Thimidinkinasen, eine zelleigene und eine virale.

Ganciclovir wird (vorwiegend) von der viralen phosphoryliert.

Ist nur die zelleigene vorhanden (durch den Einbau eines Genabschnitts ins virale TK Gen) haben diese Zellen einen Wachstumsvorteil, da die Zellen mit viraler TK Ganciclovir in die DNA einbauen.

Die "TK negativen" Zellen sind also nur negativ bezüglich der viralen TK.

lg

Hm, ich habs mir nochmal genauer angesehen und es funktioniert wohl doch anders (einfacher):

Es wird ein rekombinantes Plasmid hergestellt, bei dem das virale TK Gen zerschnitten wird.

Mit dem Plasmid wird eine TK negative Zelle transformiert, die aber einen Wildtyp Vaccinia Virus trägt (der hat eine TK).

Durch homologe Rekombination zwischen der Wildtyp Vaccinia DNA und dem Plasmid kann das TK Gen aus dem Wildtyp entfernt werden.

Dann wird auf TK- Zellen selektioniert (mit Bromdesoxyuridin). Die selektionierten Zellen produzieren Virionen ohne TK, allerdings mit Fremd-DNA. Diese Fremd-DNA ist z.B. ein Gen für ein virales Hüllprotein (von einem anderen Virus).

Es werden also hybride Viruspartikel ohne Thymidinkinase gezüchtet, zur Verwendung als Impfstoff.

Gefunden im Brock Seite 1030 (deutsche Version).

Ganciclovir ist wohl einfach als alternative Selektionsmöglichkeit aufgeführt?!

lg

Aah, danke, ich glaub ich habs jetzt... Die TK-neg. Zellen synthetisieren Thymidin über die de novo synthese anstatt 5BrdU oder Ganciclorvir via TK in die DNA einzubauen, daher sterben sie nicht - richtig?
Also Vaccinia wird einerseits als Impfstoff vermehrt, andererseits als vector für den Gentransfer für die Proteinproduktion eingesetzt (auch proteine anderer viren, die dann als impfstoff dienen) - dann sollte sich der Virus nicht vermehren, daher nimmt man propagation incompetent (rekombinante) viruspartikel, die sich ins wirtsgenom integrieren. Aber was ist eig. der Unterschied zwischen Transduktion und Virusinfektion zum Zweck des Gentransfers (Folie 6)?

Transduktion ist der Transfer von DNA die nicht zum eigentlichen Virus gehört, soweit ich das verstanden hab. Also wenn z.B. bakterielle DNA in Virionen verpackt und auf ein anderes Bakterium übertragen wird, ist das wohl keine Infektion.

Bei einer Virus-Infektion trägt das Virus seine eigene DNA (oder im Falle eines rekombinanten Virus zumindest Teile davon).

lg

hey, ich glaube der entscheidende Unterschied zwischen Transduktkion und Infektion ist, dass bei der Transduktion der Virus sich dann nicht weiter vermehren kann, er dient also nur als Überträger (macht auch Sinn wenns schon transduction heißt) allerdings bin ich mir nicht sicher ob die viren bei der Virus-Infektion auch propagation incompetent sind oder nicht ..

LG

Last second questions
Wer weiß noch was dazu:
Worauf muss man bei der Produktion rekombinanter Proteine für den Einsatz als Pharmazeutikum achten in Hinblick auf...

expression system/host cell line - able to do correct PTMs, grow to high density (eg. HEK), stable, shear force tolerant, suspension growth
media - protein-/animal derived component free
gene expression cassette - codon otimized, transcription+translation start optimized
screening system - ??
selection/amplification system - no antibiotics
vector - stability?

Wovon hängt das Glykosylierungsmuster ab? Vom Zelltyp und Funktion des Protein?? Das wäre etwas trivial...

Compartmentalization of Penicillin production: wie kann dadurch die Ausbeute gesteigert werden?

alles in allem sind das auch die fragen bei denen ich mir nicht ganz sicher bin was alles als antwort gelten könnte.

zum selection amplification system: dominante marker können für so gut wie alle zellen angewandt werden für die rezessiven brauch ich die spezifische deficiency, und man sollte bei secreted proteins kein secreted selection marker verwenden (wie zb. beta lactam) ich glaub das steht eigentlich im mattanovich teil ist aber deswegen hoffentlich nicht falsch.
screening - schnell zuverlässig billig? irgendwas in die richtung, HTP ..
vector - stability wsl in zusammenhang mit expression level, zb HEK.EBNA durch E1a gene .. und dass immer alles zusammenpassen muss zb pet system nur mit T7 promotor auf dem vektor usw.

glycosylierung - ich würd fast hinschreiben, dass es tw davon abhängt wie viele sites am protein zu finden sind also sprich thr und ser bzw hydroxylysin für O-glycosylierung .. und halt von den host proteins, dann kann man sicher noch hinschreiben, dass es halt verschiedene typen gibt, high mannose, hybrid und complex .. oder so.

und bezüglich der compartments bei penicillin .. kA .. vielleicht ist die storage form eine andere als die aktive - wie zb beim transport von glucose - umwandlung in g6p um den transport aufrecht zu erhalten ? ??


weiß vielleicht jemand was zu: Welche unterschiedlichen Arten von Vektoren gibt es?

LG

Zu penicillin hab ich im internet gefunden, dass man die anzahl peroxisomen erhöhen kann und dadurch die ausbeute steigern. weiß aber nicht ob es das ist, was er hören will. Hab grad gesehen, eine andere Frage ist, welche precursor es gibt (Phenylacetat und Phenoxyacetat) und wie davon ausgehend die Ausbeute gesteigert werden kann - ??

Arten von Vektoren, hm, auf wikipedia steht mal plasmid und viral vectors und cloning und expression vectors, integrating und episomal vectors, replacement und insertion?, eukaryotic, prokaryotic und shuttle? Ich rate...

Und Vergleich spez. Produktivität von E.coli und tierischen Zellkulturen? Angabe für E.coli in (g oder mol)/L*h, also volumetrisch, und in cell culture pg/cell*day, also spezifisch pro zelle?

wegen der ausbeute sachen würd ich bei den precursors einfach hinschreiben, dass das den flux steigert, mehr ausgangsstoff mehr endprodukt, so in der art. was besseres fällt mir dazu auch nicht ein.

in der allgemeinen tabelle steht für bacteria mg/gDCW/h oder tag je nachdem .. und für animal cell culture würd ich das ganze in µg/miocells/d angeben (so wies auch bei den verschiedenen berechnungsmethoden immer steht) vl pg/cell/d noch zusätzlich .. und vielleicht noch a bissi was dazuschreiben erklärend

Weil ich das gerade lese, ja die Folie mit Ganciclovir ist etwas verwirrend. Eigentlich verwendet man es zur negativen Selektion (= die Zellen kann irgendetwas nicht) von knockout-Mäusen, um sicher zu gehen, dass ein Gen durch homologe Rekombination (also an der richtigen Stelle und nicht durch zufällige Integration) eingebaut wurde.

Der Vektor hat z.B. ein gene of interest das man integrieren möchte und ist von homologen Sequenzen (die entscheiden, wo es integriert werden soll) flankiert. Zusätzlich kann innerhalb der homologen Bereiche noch ein positiver Selektionsmarker (meist Neomycin, genauer gesagt Geneticin G418) neben dem GOI liegen.
Wird der Vektor durch h.R. eingebaut, besitzen die Zellen zwar eine G418-Resistenz, haben aber keine funktionierende HSV-tk (lag ja außerhalb der homologen Arme). Sie überleben eine Behandlung mit Ganciclovir, da die zelleigene, nicht-virale tk Ganciclovir nur schlecht phosphoryliert/aktiviert.

Kam es jedoch zu zufälliger Integration ins Genom, wurde der gesamte Vektor eingebaut (http://www.nature.com/nrg/journal/v6/n6/fig_tab/nrg1619_F4.html) und Ganciclovir killt die Zelle weil die virale HSV-tk es ungefähr 1000x effizienter phosphoryliert als die tierische.

Eine Möglichkeit, Ganciclovir als Selektionsmarker für rekombinante Expression zu verwenden, wäre das Vaccinia System. Man verwendet anstatt eines WT-Vaccinia Virus einen, der HSV-tk enthält - somit sterben die Zellen bei Zugabe von Ganciclovir. Zerstört man diese mittels Integration durch homologe Rekombination unseres gene of interest, macht es ihnen nix mehr aus.

Dieser Link zeigt die Möglichkeiten von homologer Rekombination (gene mutation, gene inactivation, conditional knockout, knock-in und die Arten der Vektoren - replacement oder insertion vectors):
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2782548/